Uzorci tkiva mumija pod imenima "Maria" i "Vavita" poslani su iz Perua u ruski laboratorij na istraživanje. Pruženi uzorci bioloških tkiva proučavani su pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije, Ramanovog spektra, ICPE i ispitivan je sastav dijatomejske zemlje (tvari na površini kože mumija). Provedeno je i istraživanje DNA prenesenih tkiva.
Priprema uzoraka
Uzorci tkiva od 500 μg preneseni su u plastične epruvete i otopljeni u 1 ml pufera (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Rezultirajućim suspenzijama dodan je Na dodecil sulfat na 0,5%, zagrijan na +80 ° C, a nakon 10 minuta proteinaza K (do 500 μg / ml) je stavljena u termostat (+55 ° C) tijekom 24 sata.
Deproteinizacija je provedena fenolskom metodom: dodavanju suspenzije fenola u jednakom volumenu, zatim fenola: kloroform (1: 1), kloroform; nakon svakog dodavanja, konstantno miješanje izvršeno je na kutnom rotoru i centrifugiranje pri 15 tisuća okr / min, 10 min.
Super-sedimentu dobivenom nakon treće centrifugiranja dodano je 1/10 dijela volumena 1 M NaCl i 2,5 volumena dvostruko destiliranog etilnog alkohola i ostavljeno preko noći na -30 ° C u konusnim epruvetama - "Eppendorf". Centrifugiranje je provedeno na 15 tisuća vol. min. u roku od 10 minuta i primila DNA "istaloženu" u obliku smeđeg taloga. DNA peleta je isprana dva puta sa 70% etilnim alkoholom i sušena na sobnoj temperaturi (1 h), a zatim je otopljena u TE puferu.
PCR je proveden na programibilnom termociklizmu "My Cycler" ("Bio = Rad") korištenjem standardnih oligoprimera koji su sintetizirani metodom na čvrstoj fazi u udruzi "Beagler" (St. Petersburg). Reakcijska smjesa za amplifikaciju s volumenom od 25 µL uključuje: 15 nM svakog oligoprimera, 67 mM Tris-HCl pH = 8,8 pri +25 C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 µM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanol, 170 µg / ml BSA i mješavina četiri osnovna dNTP-a u koncentraciji od po 1,0 mM i termostabilne DNA polimeraze Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Nakon denaturacije (10 min, 94 ° C) provedeno je 35 ciklusa amplifikacije za svaki ispitni sustav: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Da bi se kontrolirala specifičnost, u reakciju su uvedeni uzorci DNK s poznatim genotipovima ispitivanih lokusa (markerski sustavi), kao i kontrolni uzorci.koji sadrže mješavinu reagensa bez DNA. Nakon pojačanja dodan je pufer za bojenje u alikvote reakcijske smjese (7 μl) i razdvojen je vertikalnom elektroforezom u 6% poliakrilamidnom gelu (210x150x1 mm), obojen s etidijevim bromidom i fotografiran pod ultraljubičastom svjetlošću. Za identifikaciju alela korišteni su alelni standardi koji odgovaraju tim lokusima.
Promotivni video:
DNK analiza
Za istraživanje smo koristili metodu exome analize ljudske DNA koja se temelji na sekvenciranju visokih propusnih količina i obogaćivanjem hibridizacijom.
Tehnika exome analize ljudske DNK.
Analizirana su 2 uzorka … Sve faze pripreme uzorka prije PCR provedene su u čistim sobama. Priprema uzoraka, ekstrakcija DNK i amplifikacija pojedinih fragmenata DNA izvedeni su u različitim sobama.
Specifični adapteri (Kit za pripremu biblioteke KAPA i SeqCap Adapter Kit; Roche) su ligirani do krajeva genomske fragmentirane DNK (~ 5 ng), nakon čega je izvršen dvostepeni izbor fragmenata u rasponu duljine od 200-350 bp pomoću AMPureXP perle (Beckman Coulter) … Rezultirajući fragmenti su amplificirani s primjerom specifičnih primera i hibridizirani s biotiniliranim specifičnim sondama (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) tijekom 28 sati na 47 ° C. U jednoj reakciji su kombinirana dva uzorka DNK. Biotinilirani sondi-DNA hibridi izolirani su i pročišćeni magnetskim česticama konjugiranim streptovidinom, izvršeno je drugo amplifikacija i kvalitativna procjena rezultirajuće DNK biblioteke (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Da bi se uklonili fragmenti amplifikacije izvan cilja i dimeri za adaptere, DNK biblioteka je ponovno pročišćena pomoću AMPureXP Beads magnetskih čestica (Sl. 1). Konačna koncentracija pripremljene biblioteke procijenjena je na instrumentu Quantus koristeći komercijalni komplet QuantiFluor® dsDNA System (Promega). Rezultirajuća DNA knjižnica imobilizirana je na površini protočne ćelije. Sekvenciranje je izvedeno na Illumina platformi korištenjem Standard Flow Cell i MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciklusa). Rezultirajuća DNA knjižnica imobilizirana je na površini protočne ćelije. Sekvenciranje je izvedeno na Illumina platformi korištenjem Standard Flow Flow i MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciklusa). Rezultirajuća DNA knjižnica imobilizirana je na površini protočne ćelije. Sekvenciranje je izvedeno na Illumina platformi korištenjem Standard Flow Cell i MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciklusa).
Lik: 1
Opća ocjena kvalitete sekvencirane DNA
Za početnu procjenu kvalitete korištene su standardne metode poput FastQC i programa Jellyfish i KraTER. Procjena kvalitete pokazala je da nema problema s kvalitetom očitavanja sekvencirane DNA za oba uzorka. Slike se ne prikazuju jer nisu informativne.
Za prvi uzorak (daljnja M, velika mumija "Maria") sekvencirano je 113,4M čitanja, za drugi uzorak (daljnji W, mala mumija "WaWita") 22,9M čitanja su sekvencionirani.
Sljedeći korak bio je čišćenje sekvenciranih očitanja iz različitih tehničkih nizova koji bi ometali daljnju analizu. Za to je korišten program Cookiecutter. Nakon čišćenja, bilo je 113,3M (99%) očitanja i 22,8M (99%) očitanja za M i W.
Procjena količine drevne DNK i njezino odvajanje od moderne
Standardna metoda za procjenu prisutnosti i količine drevne DNA je procijeniti količinu vremenski oštećenih nukleotida. Za to je korišten program MapDamage 2.0. MapDamage 2.0 koji je pokazao količinu drevne DNK u 30,1%, ali budući da MapDamage podrazumijeva da koristimo blisku referencu, i ne znamo točno koliko su oba uzorka bliska genomu modernih ljudi, a koristili smo biblioteku exome, ova metoda sama po sebi nije bila dovoljno. Još jedna dobra metoda za procjenu drevne DNA je broj kratkih fragmenata.
Filtracija navodne drevne DNA odvijala se u tri faze. U prvoj fazi uklonili smo sva uparena čitanja koja se ne mogu prekrižiti i sastaviti u jedno neparno čitanje s preklapanjem. Ova čitanja značila su da je originalni fragment koji je sekvenciran bio duži od 300 bp. a najvjerojatnije moderni DNK. Tako je nakon ovog koraka ostalo 86,9%, odnosno 91,8%. Nakon toga odabrani su pojedinačni preklapajući fragmenti tako da je njihova duljina bila kraća od 150 bp, jer je to duljina koju smo očekivali za drevnu DNK. Nakon ovog koraka, za uzorke M i W ostalo je 8,6%, odnosno 38,5%. Treba napomenuti da je, unatoč razlici u postocima, apsolutni broj očitanja između uzoraka M i W vrlo sličan: 9,8M i 8,8M, što se može objasniti činjenicom da sadržaj drevne DNK u oba je uzorka sličan.
| Parametar | Uzorak M (Maria) | Uzorak W (Wawita) |
| Broj čitanja | 113.3M | 22.8M |
| Postotak kratkih fragmenata <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Postotak kratkih fragmenata <150 bp (broj) |
8,6% (9,846,035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Postotak fragmenata poravnatih po ljudskom genomu (broj) |
2,03% (2,345,084) |
9,65% (2,264,551) |
| Postotak fragmenata poravnanih po ljudskom genomu od kratkih <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Dobivanje DNK slično referentnom ljudskom genomu
Rezultirajuća drevna drevna DNK mapirana je na referentni genom čovjeka pomoću standardnog cjevovoda za pretraživanje genomske varijante koristeći BWA, samtools i Wcftools.
Štoviše, samo 23,8% uzorka M i 25,6% uspješno su mapirani u referentni genom suvremenih ljudi. Istovremeno, za oba se uzorka 75% očitanih sekvenciranja ne može preslikati na ljudski genom. To se može objasniti i kontaminacijom i činjenicom da su ti uzorci dovoljno udaljeni od genoma suvremenog čovjeka. Istodobno, vrijedno je imati na umu da smo sekvencionirali biblioteku egza i tako smanjili kontaminaciju bakterijske DNA.
Početna izviđačka analiza nevarenih čitanja pokazala je da neki od njih pripadaju ponavljajućoj DNK specifičnoj za kopitare, a to se može objasniti činjenicom da se mast mlaznice koristila u mumificiranju.
Detaljnija analiza zahtijeva proračune otprilike tri tjedna, budući da su postojeća rješenja napravljena samo za virusne i bakterijske genome, te se moramo usporediti sa svim postojećim genima, uključujući biljne genome, kako bismo shvatili koje su vrste sekvencionirane.
Karakteristike pronađenih opcija
Kartirana čitanja korištena su za pretraživanje varijanti koje razlikuju M i W uzorke od modernog ljudskog genoma, kao i za procjenu kontaminacije očitanja iz ljudskog Y kromosoma.
Prvo je pitanje na koje je trebalo dati odgovor bilo na koje su kromosome preslikani redoslijedi očitani.
Budući da znamo da su Marijini uzorci izolirani iz kostiju i mišića, a Vavita samo iz kostiju, očekivali smo razliku u količini mtDNA. Ali tu nije bilo puno razlike.
Broj mapiranih čitanja na Y još je jedan test onečišćenja modernog čovjeka. Zanimljivo, pokazalo se da je u oba uzorka isto.
Statistika za pronađene varijante prikazana je u nastavku:
| parametri | Uzorak M (Maria) | Uzorak W (Wawita) |
| Broj pronađenih opcija | 79.957 | 48.941 |
| Broj opcija na Y | 534 | 541 |
| Broj pouzdanih opcija (više od 20 čitanja i više od 30 kvaliteta) | 16.969 | 6181 |
| Varijante s poznatim rsidom (dostupno u datoteci snap) | 5701 | 3089 |
| Općenito važeće opcije | 92 | |
| uobičajene opcije s rsidom | 49 |
Nakon toga postalo je moguće odgovoriti na pitanje: jesu li rođaci M i W? Odgovor je ne.
Pronađeno je samo 49 varijanti podudaranja između M i W i 3040 koje se razlikuju za varijante s poznatim rsidom. Štoviše, možda se radi o različitim vrstama ili podvrstama osobe ili nepoznatog bića.
Zanimljivo je da su inačice s Y kromosomom identične za oba uzorka, što ukazuje na kontaminaciju od iste osobe, te da u drevnoj DNK Y kromosoma vjerojatno još uvijek nema kromosoma.
Procjena sličnosti s postojećim sekvenciranim ljudskim genomima iz projekta 1000 ljudskog genoma
Imajte na umu da je ovo samo približna analiza, jer su za točniju analizu potrebne varijante iz područja genoma pod neutralnim odabirom, a imamo podatke o exome.
Ipak, koristeći 5708 varijante za M ili 3096 za S, bilo je moguće provesti varijantu analize u usporedbi s podacima o 1000 ljudskih genoma.
Rezultat PCA analize na donjoj slici je prekrivanje dvije slike za M i W, izračunato odvojeno, jer je premalo uobičajenih opcija između M i W za procjenu udaljenosti između M i W.
Ocjena sličnosti.
Kao što vidite, ne postoji slučajnost s bilo kojom skupinom gena, oni se također razlikuju jedan od drugog. No treba imati na umu da smo kod odabira koristili kodirajuće sekvence, pa se preporučuje upotreba varijanti pod neutralnim odabirom.
Ipak, rezultat PCA-e je u dobrom suglasju s ručnom provjerom varijanti, koja je pokazala da su podaci u nereferenciranom homozigotu, što opet ukazuje na to da su slike daleko od modernog ljudskog genoma.
Zaključak
Nažalost, bili smo ograničeni na samo dva uzorka, obično se u ovoj vrsti analiza više koristi, barem 3-10, barem nekako povezano. Stoga je potrebno nastaviti s istraživanjem velikog broja uzoraka.
Istovremeno, najvjerojatnije možemo zaključiti da DNK uzorci Marije i Vavite odgovaraju ljudskoj DNK, ali ne podudaraju se s DNK-om koji nam je dostupan iz baze podataka od 1000 ljudi.
Autori izvještaja: Baranov V. S. i Aseev M. V. (Znanstveno-istraživački institut za akušerstvo i ginekologiju, Zavod za prenatalnu dijagnostiku), Glotov A. S. i Glotov O. S. (Državno sveučilište u Sankt Peterburgu), A. S. Komissarov (Institut za citologiju Ruske akademije znanosti, Centar za genetsku bioinformatiku).
Građa koje su osigurali Konstantin Georgievich Korotkov (doktor tehničkih znanosti, profesor, Sveučilište za informacijske tehnologije, mehaniku i optiku) i Dmitrij Vladislavovich Galetsky (kandidat medicinskih znanosti, I. P. Pavlov Prvo državno medicinsko sveučilište u Sankt Peterburgu).
Više o Nazca mumijama pogledajte oznaku: Nazca mumije.
