Izum CRISPR-Cas uređivača gena naziva se revolucijom u biologiji. Znanstvenici obećavaju da će ga koristiti za poboljšanje biljnih sorti i pasmina životinja u poljoprivredi, za liječenje prirođenih genetskih bolesti kod ljudi. Dopisnik RIA Novosti otišao je vidjeti tko i kako uređuje genom.
Centar za uređivanje genoma Moskovskog državnog sveučilišta otvoren je prije nešto više od godinu dana - na kampusu. Upoznaje me njegov direktor, doktor kemije Peter Sergiev, i dok se vozimo u dizalu, on se malo posvećuje povijesti genetskog inženjerstva.
Genom je ranije uređivan. Ali bilo je teško stvoriti alate za to, dugo je trajalo, a rezultat često nije bio onakav kakvog smo željeli “, kaže on.
U vivariju se Pyotr Vladimirovich presvuče u plavu laboratorijsku odjeću, daju mi jednokratni bijeli kombinezon i traže da obrišem kameru alkoholom. Sada Petr Vladimirovič izgleda poput kirurga, a ja - kao laboratorijski asistent iz serije "CSI - mjesto zločina".
U sterilnom laboratoriju za nas su pripremljeni spremnik s oplođenim mišjim jajima i epruveta s RNA otopinom. To je sve što vam treba za uređivanje genoma CRISPR-Cas.
CRISPR je engleski kratica za frazu koja doslovno znači "redovito grupirana kratka palindromska ponavljanja". Zapravo, to su samo mali dijelovi DNA bakteriofagnih virusa ugrađenih u bakterijski genom. Ti nizovi potrebni su za funkcioniranje imunološkog sustava bakterija i služe kao svojevrsna najava "policajac koja traži". Ako bakterija preživi nakon što je zaražena bakteriofagom, pomoću enzima proteina Cas izrezati će djelić svoje DNK i umetnuti ga u svoj genom da bi se kasnije prepoznao. Bakterijski genom nasljeđuje ovu biblioteku "neprijatelja" pomno sakupljenih od prethodnih generacija.
Znanstvenici su 2013. otkrili da protein Cas djeluje u bilo kojem organizmu, uključujući sisavce. Sposoban je napraviti usmjerene prekide u oba lanca molekule DNA i tako promijeniti genom.
Promotivni video:
Manipulacija jajima
Petr Sergiev pravi mikro staklenu kapilaru promjera sto mikrona, u nju uvlači jaje i prenosi ga pod staklo hranjivim medijem. Gotov uzorak šalje se u fazu optičkog mikroskopa. Monitor prikazuje uvećanu sliku jajašca koja drhti na vrhu kapilare. Izdvajaju se dvije zaobljene točke - to su pronuklei s DNK majke i oca.
Znanstvenik priprema još jednu kapilaru veličine manjeg promjera. Ovo je injekcijska štrcaljka. Skuplja otopinu s dvije vrste RNA u nju i uz pomoć manipulatora nježno probija jaje. To je to, injekcija je učinjena.
RNA ubrizgana u jaje potrebna je za rezanje genoma na određenom mjestu. Jedna vrsta RNA sadrži strogo definiran niz nukleotida, sličan onome koji smo namjeravali promijeniti. Zadatak ove RNA je pronaći odgovarajuću regiju u DNK, pa se zato naziva "vodič". RNA drugog tipa, matriks, svojevrsna je upute za sintezu Cas9 nukleaznog proteina. Ovaj protein djeluje kao katalizator kemijske reakcije koja razbija fosfodiesterske veze između dobro definiranih baza DNA. Budući da molekula proteina ima dva nukleazna centra, obje DNA lance se otvaraju, štoviše, na mjestu, čija je koordinata "računala" s vodičem RNA.
Molekul DNK lom u oba lanca shvaća kao ozbiljan kvar i nastoji ga popraviti. Enzimi egzonulea koji lebde u stanici odmah uklanjaju nekoliko nukleotida s oba kraja prekida. To je dovoljno za razbijanje ili, kako genetičari kažu, "isključivanje" gena.
Kako funkcionira CRISPR-Cas9 genomski urednik / Ilustracija RIA Novosti. Alina Polyanina.
Ako je, primjerice, potrebna usmjerena mutacija, potrebno je označiti protein kako bi ga se pratio u tijelu, tada se u dva RNA dodaje još jedan predložak u obliku posebno dizajnirane DNK. Sastoji se od nizova identičnih rubovima budućeg loma, a sadrži i odjeljak koji se treba umetnuti. Nakon što je Cas9 izrezao molekulu DNA, njeni krajevi se povezuju pomoću ovog dodatnog predloška, pa se skup potrebnih nukleotida ubacuje u proboj.
Na vjevericu možemo pričvrstiti mali rep, pomoću kojeg je zgodno izvući je i vidjeti s čime ona djeluje. Možemo umetnuti gen, ali on nije toliko učinkovit kao isključivanje”, nastavlja objašnjavanje znanstvenik.
GMO i himere
Uređeno jaje će biti transplantirano u maternicu surogat miša. Neko je vrijeme živjela s mužjakom kojem su sjemenikaste tubule bile vezane. Par je imao normalan seksualni život, ali nije mogao začeti. Unatoč tome, mišje tijelo je vjerovalo da je trudna, te je oblikovalo odgovarajuću hormonalnu pozadinu za nju. Sada ova ženka nosi tuđi plod.
Za tri tjedna rodit će najobičnije miševe. Znanstvenici će pričekati dok glodavci odrastu, uzeti će im mali komadić repa i pomoću PCR-a analizirati dio DNK koji su uredili. Mutacija ili onesposobljeni gen nalazimo u više od polovice slučajeva. Obrnuti postupak - umetanje niza u genom - uspijeva u ne više od 10% pokusa.
Pri uređivanju se pojavljuju razni zanimljivi efekti. Na primjer, rađaju se mozaični miševi ili himere koji imaju stanice s različitim varijacijama genoma majke i oca. Cas9 može rezati DNA mnogo puta, ali glasnik RNA koji ga kodira nije vječan, a ubrizgana otopina jednostavno nestaje u nizu staničnih podjela. Ponekad se urednik još uvijek aktivira nakon što se pronukleus spoji i jaje se podijeli. A budući da je popravljanje DNK nakon rupture uvijek slučajni proces i izlječenje se nikada ne događa na isti način, neke će stanice u jednom organizmu sadržavati drugu mutaciju.
Za znanost i medicinu
Ulazimo u susjednu sobu kako bismo promatrali rezultate eksperimenata u uređivanju genoma. Na policama s lijeve strane - spremnici s genetski modificiranim miševima, s desne strane - s uobičajenim glodarima za suzbijanje. Uzgajane su, poput onih s lijeve strane, ali genom nije manipuliran. Kontrolni miševi potrebni su kako bismo imali normu pred našim očima i uspoređivali stvorenja dobivena u eksperimentu s njom.
Pyotr Sergiev uzima jedan od kontejnera s parom sivih miševa. Izvana su sasvim obične, ali nemaju potomstvo. Činjenica je da je u muškaraca isključen gen jedne od RNK metiltransferaze, enzima proizvedenog samo u spermi. Mužjaci s neaktivnim genom rađaju se sterilno. Točna svrha gena i enzima još uvijek nije poznata. Da bismo to saznali, u laboratoriju su uzgajana dva soja miševa: jedan je isključio gen, drugi ima protein označen genomskim uređivačem.
„Mutacija ovog gena nalazi se i kod ljudi - tada čovjek pati od neplodnosti. No dok ne otkrijemo zašto je potrebna, zašto modificira RNA, takvim pacijentima nećemo moći pomoći”, navodi znanstvenik.
U stvari, još uvijek ne znamo funkciju većine ljudskih gena. Otkrivanje ovo je temeljni zadatak koji su riješile mnoge istraživačke skupine širom svijeta, uključujući i Rusiju. Genom miša vrlo je sličan onome u ljudi. Nadamo se da će pomoću CRISPR-Casa proučavanje genoma bilo kojeg bića ići brže.
Sergijeva skupina zajedno s N. N. NN Petrova krenula je u potragu za mutacijama koje dovode do nekih vrsta karcinoma. Najbliži planovi uključuju projekt stvaranja genetski modificiranih životinja za poljoprivredu u suradnji s Ruskim istraživačkim institutom za stočarstvo i Institutom za genetsku biologiju Ruske akademije znanosti.
„CRISPR-Cas je fantastičan alat koji vam omogućuje da promijenite genom po vlastitom nahođenju, da budete pomalo Bog. Konačno, zadatak znanosti je razumjeti kako djeluje tako složeno stvorenje poput sisara “, kaže znanstvenik.
Rješavanje temeljnih problema znanosti je sjajno, ali što će ova tehnologija dati medicini? U doglednoj budućnosti, nažalost, ne puno. Jednostavno je urediti jaje i odgajati genetski modificiranog miša, ali nemoguće je ispraviti gene odrasle životinje, a kamoli čovjeka.
Metode za uređivanje DNK u somatskim (to jest već formiranim stanicama) još uvijek su vrlo neučinkovite. Da biste unijeli u stanicu neki gen isključen mutacijom i prisilio ga da proizvodi određeni protein, morate ukloniti neke stanice iz tijela, urediti DNK u njima i vratiti ga u tijelo. U principu, postoji nada da će se na ovaj način moći boriti protiv bolesti poput Duchennove mišićne distrofije ili cistične fibroze, kada je potrebno obnoviti radnu sposobnost nekih dijelova stanica. Što se tiče predispozicije za rak, do sada je genski urednik nemoćan. Ako se mutantni gen nađe u osobi, tada se nalazi u svim stanicama tijela. Nerealno ih je sve promijeniti. A svaka ćelija s mutacijom predstavlja opasnost.
Ali čak i ako će CRISPR / Cas pomoći odgovoriti na samo neka temeljna pitanja i omogućiti liječenje rijetkih genetskih bolesti, to će čovjeku ipak biti veliki korak naprijed.
Tatjana Pichugina