Genetski inženjering otvara mogućnosti čovječanstvu za stvaranje nepostojećih organizama i uništavanje genetskih bolesti. Međutim, stvari nisu tako ružičaste, jer čak ni proboj tehnologije CRISPR / Cas9 još uvijek nije savršen. Pogreške koje ona čini mogu biti rijetke, ali jedna je dovoljna da postane fatalna za osobu. Lenta.ru govori o tome što nije u redu s CRISPR-om i kako znanstvenici pokušavaju popraviti situaciju.
Sustav CRISPR / Cas9 - svojevrsne DNA škare - s pravom se smatra revolucijom na polju genetskog inženjeringa. Uz njegovu pomoć, znanstvenici mogu uređivati ljudski genom, uklanjajući mu štetne mutacije i tako liječiti neugodne i smrtonosne nasljedne bolesti. Ne treba, međutim, misliti da prije nije bilo takvih metoda. U arsenalu genetičara nalazile su se, na primjer, nukleaze koje sadrže cinkove "prste" i endonukleaze - enzime koji razbijaju molekule DNA na određenim mjestima. Što se tiče točnosti, svestranosti i cijene, primjetno su inferiorni u odnosu na CRISPR / Cas9, iako potonji i dalje nije savršen.
CRISPR / Cas9 izvorno nisu stvorili znanstvenici, već priroda. To je molekularni mehanizam unutar bakterija koji im omogućuje borbu protiv bakteriofaga i drugih parazita. Zapravo djeluje kao imunitet protiv infekcije. CRISPR (kratice za "kratke palindromske ponavljanje, redovito raspoređene u skupine") su posebna područja (lokusi) DNA. Sadrže kratke fragmente DNA virusa koji su nekad zarazili pretke današnjih bakterija, ali su poraženi njihovom unutarnjom obranom. Ti se dijelovi nazivaju odstojnicima i međusobno su odvojeni ponavljanjem sekvenci.
Kad bakteriofag napadne bakteriju, svaki ponavljajući slijed i susjedni odstojnik koriste se kao predložak za sintezu molekula nazvanih crRNA. Stvoreni su mnogi različiti lanci RNA, koji se vežu za protein Cas9, čiji je zadatak izuzetno jednostavan: presjeći DNA virusa. Međutim, on će to moći učiniti tek nakon što crRNA pronađe komplementarni fragment virusne DNA. Nakon što Cas9 razdvoji stranu nukleinsku kiselinu, ona je u potpunosti uništena drugim nukleazama.
CRISPR / Cas9 dobar je upravo zbog svoje točnosti, jer je za bakterije pravilno funkcioniranje imunološkog sustava pitanje života i smrti. "Antivirusni" sustav treba pronaći odjeljak virusne DNA među milijun drugih i, što je najvažnije, ne miješati ga s vlastitim genomom. Tijekom milijuna godina evolucije, bakterije su usavršile ovaj mehanizam. Pa odmah nakon što su shvatili zašto je potreban CRISPR sustav, shvatili su da ga se može ukrotiti kao neviđeno precizan alat za uređivanje gena.
Da bi se jedno određeno područje u genomu zamijenilo drugim, potrebno je sintetizirati vodeću RNA koja je u principu slična crRNA. Kaže Cas9-u gdje je potrebno napraviti dvolančani prekid u DNK modificiranog organizma. Međutim, ne trebamo pokvariti gen, već ga modificirati - na primjer, zamijeniti jedan ili više nukleotida i ukloniti štetnu mutaciju. Tu priroda ponovno dolazi u pomoć. Prirodni mehanizmi za popravak odmah počinju obnavljati prerezani lanac. Trik je u tome što se za to neki fragmenti RNA uklanjaju blizu prekida, nakon čega se tamo ubacuju slični nizovi. Znanstvenici ih mogu zamijeniti vlastitim sekvencama DNA i tako modificirati genom.
Shematski prikaz CRISPR-a
Promotivni video:
Slika: Kaidor / Wikipedia
Međutim, ništa nije savršeno. Unatoč svojoj relativnoj točnosti, CRISPR ponekad griješi. Jedan od razloga leži u samoj prirodi sustava. Nepovoljno je da se bakterije za crRNA podudaraju za 100 posto s fragmentom virusne DNA, koji se može razlikovati za jedan ili dva nukleotida. Za nju je bolje da neki nukleotidi mogu biti različiti, što mikroorganizmu daje veće šanse za borbu protiv infekcije. Istodobno, u genetskom inženjerstvu, mala specifičnost prijeti pogreškama: promjene se mogu napraviti na pogrešnom mjestu. Ako se to dogodi tijekom eksperimenata na miševima, neće biti posebne tragedije, ali uređivanje ljudskog genoma moglo bi se pretvoriti u katastrofu.
To objašnjava zabrinutost zapadnih znanstvenika eksperimentima koji se provode u Kini. Azijski istraživači koristili su CRISPR tehnologiju za genetsku modifikaciju ljudskih embrija. Takvi su eksperimenti zabranjeni u Europi i Sjedinjenim Državama, ali nedavno ih je Velika Britanija dopustila - isključivo u istraživačke svrhe. Takvi će se embriji morati uništiti za nekoliko tjedana nakon primanja, što isključuje "uzgoj" GM ljudi.
Međutim, CRISPR / Cas9 ne bi bio sjajan da se ne može poboljšati. Znanstvenici su naučili Cas9 da ne odsiječe dva lanca odjednom, već samo jedan. Rez se vrši na dva različita mjesta u sekvenci DNA na različitim nitima, tako da sustav mora biti u stanju prepoznati dvostruko više nukleotida od normalnog, čineći ga preciznijim.
Protein Cas i crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Znanstvenici sa Sveučilišta Western Ontario pronašli su još jedan način za poboljšanje ove tehnologije. Pokušali su riješiti problem popravljanja presječene DNA. Brza obnova lanca nukleinske kiseline dovodi do činjenice da znanstvenici nemaju vremena za vlastiti ispravak u genomu. Tako se stvara začarani krug: lanac, popravljen na neželjeni način, mora se ponovno presjeći s proteinom Cas9.
Da se to ne bi dogodilo, istraživači su modificirali proteinske škare kako bi stvorili protein TevCas9. Na dva mjesta presijeca lanac DNK, što otežava popravak mjesta. Da bi sintetizirao novi enzim, u Cas 9 je dodan enzim I-Tevl, koji je ujedno i endonukleaza, odnosno protein koji cijepa molekulu DNA u sredini, umjesto da odcijepi krajeve sekvence, kao što to čine egzonukleaze. Pokazalo se da je rezultirajući fuzijski protein točniji u vezivanju za određena mjesta i da je manje vjerojatno da će pogriješiti i izrezati pogrešno mjesto.
Kristalna struktura Cas9 vezana za DNA
Foto: projekt wi9 Cas9 / Wikipedia
Postoji još jedan način za poboljšanje točnosti CRISPR sustava. "Trka u naoružanju" između bakterija i virusa dovela je ne samo do razvoja obrambenih sustava u mikroorganizmima, već i do načina njihove neutralizacije. Dakle, bakteriofagi brzo mutiraju, gubeći područja po kojima ih bakterijski imunitet prepoznaje. Međutim, neki kod za proteine anti-CRISPR ometaju rad kompleksa crRNA-Cas9.
Časopis Cell objavio je 8. prosinca članak znanstvenika sa Sveučilišta u Torontu koji su stvorili "anti-CRISPR" - sustav koji omogućuje isključivanje mehanizma pod određenim uvjetima. Sprječava neželjene pogreške suzbijanjem aktivnosti Cas9 u slučaju da se vodeća RNA veže za pogrešan fragment. Anti-CRISPR sastoji se od tri proteina koji inhibiraju nukleazu i kodirani su genima jednog od bakterijskih virusa.
Već se tehnologija CRISPR koristi za liječenje ozbiljnih bolesti poput leukemije i raka pluća, a također se testira i za čišćenje imunoloških stanica od HIV-a. Kako znanstvenici pronađu nove načine za poboljšanje ove metode, otvarat će se sve više i više mogućnosti za njezinu primjenu.
Aleksandar Enikeev
