Znanstvenici polažu velike nade u tehnologiju CRISPR / Cas9 koja omogućuje visoko precizne promjene u genomima živih organizama, uključujući ljude. Objavljeni su svi novi znanstveni članci koji opisuju razne vrste CRISPR sustava, kao i njihove modifikacije. "Lenta.ru" govori o otkrićima na ovom području, napravljenim 2016. godine.
Tisuće njih
CRISPR / Cas9 je bakterijski prilagodljivi imuni sustav koji omogućuje mikroorganizmima da se bore protiv virusa. Sastoji se od odstojnika - DNA dijelova koji odgovaraju određenim fragmentima (protospaceri) DNA infektivnog agensa. Razmaknice kodiraju specifične molekule crRNA koje se vežu za enzim Cas9. Rezultirajući kompleks pričvršćuje se na DNA lanac virusa, a Cas9 djeluje poput škara, režući ga.
Zapravo je CRISPR / Cas9 samo jedan od mnogih sličnih sustava koje imaju bakterije i arheje. Znanstvenici ih dijele u dva razreda. Prva klasa uključuje CRISPR sustave tipova I, III i IV, a druga - II i V. Tip II sadrži protein Cas9 koji sudjeluje u akviziciji novih odstojnika, akumulaciji crRNA u stanici i cijepanju DNA. U drugim se sustavima u te svrhe koriste multi-proteinski kompleksi. To čini tip II najjednostavnijim tipom CRISPR sustava pogodnog za potrebe genetskog inženjeringa.
Tipovi se pak mogu podijeliti na podtipove, ovisno o tome koji su dodatni geni povezani s CRISPR-om. Na primjer, IIA sustavi sadrže gen csn2, koji kodira protein koji se veže za DNA i sudjeluje u akviziciji odstojnika. U IIB sustavima csn2 nema, ali postoji gen cas4, čija je funkcija još uvijek nepoznata, a IIC sustavi nemaju ni csn2 ni cas4.
Blago unutar bakterija
Promotivni video:
Sve poznate CRISPR sustave znanstvenici su otkrili u bakterijama uzgojenim u laboratorijskim uvjetima. Međutim, postoji ogroman broj nekultiviranih mikroorganizama, koji uključuju i arheje i bakterije. Obično žive u ekstremnim uvjetima - mineralnim izvorima ili otrovnim vodenim tijelima u napuštenim rudnicima. Međutim, istraživači mogu izolirati DNA od njih i identificirati određene regije u njoj. U novom radu objavljenom u časopisu Nature 22. prosinca, genetičari sa Kalifornijskog sveučilišta Berkeley dekodirali su genome iz prirodnih mikrobnih zajednica otkrivajući druge varijacije CRISPR sustava.
Bakteriofag - virus koji zaražava bakterije
Slika: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Znanstvenici su uspjeli doznati da neke vrste malo proučenih arheoloških nanoorganizama ARMAN također posjeduju CRISPR / Cas9, iako se prije vjerovalo da ih imaju samo bakterije. Primijećeno je da ovaj sustav zauzima srednji položaj između podtipova IIC i IIB i može poslužiti kao obrana od parazitskih gena koji skaču (transpozoni) koji ulaze u mikroorganizam iz drugih arheja. Pokušaj reprodukcije aktivnosti arhealnog CRISPR / Cas9 u E. coli (Escherichia coli) nije doveo do ničega, što ukazuje na postojanje nekih dodatnih specifičnih mehanizama koji reguliraju sustav.
Nove vrste sustava iz druge klase, CRISPR / CasX i CRISPR / CasY, također su izolirane od bakterija koje žive u podzemnoj vodi i sedimentima. Sustav CRISPR / CasX uključuje proteine Cas1, Cas2, Cas4 i CasX. Potonja se, kao što su pokazali eksperimenti na E. coli, odlikuje nukleaznom aktivnošću, odnosno sposobna je cijepati stranu DNA poput Cas9. Međutim, to se događa samo ako je TTCN sekvenca ispred protoprostora, gdje je N bilo koji od četiri nukleotida. Takve se sekvence nazivaju PAM (protospacer susjedni motiv - motiv uz protospacer). Sustav CRISPR / Cas9 također ima vlastiti PAM - NGG, koji bi se trebao nalaziti nakon protospacera. Uz to, CRISPR / CasY može rezati DNA ako postoji TA PAM sekvenca u blizini ciljanog mjesta.
Što je obećanje ovog otkrića? Činjenica je da su otkriveni sustavi trenutno najkompaktniji od poznatih sustava. Prema znanstvenicima, mala količina proteina potrebna za njihov rad čini CRISPR / CasX i CRISPR / CasY prikladnim alatima za uređivanje DNA. Štoviše, metagenomska istraživanja, u kojima se proučava DNK dobivena iz okoliša, otkrit će druge vrste CRISPR sustava korisnih za genetski inženjering.
Put do izvrsnosti
Naravno, postoji alternativa potrazi za CRISPR sustavima u prirodi - poboljšanje već postojeće CRISPR / Cas9 tehnologije. Unatoč svojoj visokoj točnosti, ona griješi rezanjem DNA na pogrešnom mjestu. To otežava ispravne promjene u genima i stoga učinkovito liječi nasljedne bolesti. Stoga znanstvenici traže načine za poboljšanje performansi sustava. U 2016. godini bilo je mnogo znanstvenih radova posvećenih modificiranju CRISPR-a i njegovom pretvaranju u razne genske alate.
Protein Cas9 i crRNA - glavne komponente CRISPR sustava
Slika: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Tako je 8. prosinca časopis Cell objavio članak znanstvenika sa Sveučilišta u Torontu koji su stvorili "anti-CRISPR" - sustav koji isključuje mehanizam pod određenim uvjetima. To omogućuje suzbijanje aktivnosti Cas9 ako se RNA vodiča veže za pogrešan fragment i spriječi pogreške. Anti-CRISPR sastoji se od tri proteina koji inhibiraju nukleazu. Prirodno, u početku ga nisu izmislili znanstvenici, već virusi, koji su na taj način neutralizirali imunitet bakterija.
U lipnju su američki istraživači, zajedno s kolegama iz Rusije, potvrdili da je sustav CRISPR / C2c2, dobiven iz fusobacterium Leptotrichia shahii, sposoban cijepati jednolančanu RNA. Kao rezultat, sustav CRISPR može se koristiti za nokautiranje - suzbijanje funkcija - glasničke RNA, koja prenosi informacije od gena do ribosoma, gdje se na njegovoj osnovi sintetiziraju proteini.
U svibnju su stručnjaci za UCLA stvorili tehnologiju CRISPR-EZ koja omogućava umetanje novih molekula DNA u genom mišjih embrija s gotovo stopostotnim uspjehom. Sustav CRISPR / Cas9 uvodi se u oplođena jajašca životinja pomoću mikroskopske igle i sitnog električnog pražnjenja. U svom su eksperimentu znanstvenici uspjeli uvesti mutaciju gena u 88 posto miševa. To premašuje broj genetski modificiranih miševa proizvedenih CRISPR uređivanjem, koje koristi konvencionalne injekcije.
U travnju, koristeći mutantnu varijantu Cas9 kojoj nedostaje aktivnost nukleaze, molekularni biolozi sa Medicinskog fakulteta Sveučilišta Massachusetts razvili su tehnologiju CRISPRainbow. Vodič RNA, koji pokazuje gdje se enzimi vežu, sadržavao je fluorescentne oznake, što omogućuje, na primjer, praćenje kretanja mobilnih genetskih elemenata.
Komarac Anopheles možda je prva žrtva CRISPR sustava
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Hrabri novi svijet
Znanstvenici već koriste CRISPR sustave za stvaranje genetski modificiranih organizama, poput malarijskih komaraca, koji šire štetne gene među svojim divljim rođacima. Ova metoda se naziva genski pogon. Ako je jedan od roditelja pojedinca bio nositelj mutirajućeg gena, tada će ga s 50 posto vjerojatnosti prenijeti na svoje potomstvo. To je zato što roditelj ima dvije kopije gena, a samo je jedna neispravna. CRISPR može kopirati mutirani fragment i umetnuti ga u zdrav gen. Kao rezultat, potomci dobivaju mutaciju sa 100% vjerojatnosti.
2016. godine stručnjaci Savjetodavnog odbora za rekombinantnu DNA (RAC) odobrili su prijavu Sveučilišta Pennsylvania za provođenje testova na genetskoj modifikaciji čovjeka korištenjem tehnologije CRISPR / Cas9.
Međutim, pretekli su ih Kinezi. U studenom je časopis Nature izvijestio da su kineski znanstvenici prvi put unijeli stanice s genima modificiranim sustavom CRISPR / Cas9 u ljude. Istraživači su iz krvi pacijenta izvadili imune stanice (T-limfocite) s metastatskim karcinomom pluća, a zatim su pomoću CRISPR tehnologije isključili gen koji kodira protein PD-1. Pokazano je da potonji potiskuje imunitet promicanjem rasta tumora. Znanstvenici su obrađivali uređene stanice, povećavajući njihov broj, a zatim ih ubrizgavajući natrag u ljudsko tijelo. Hoće li se genska terapija nositi s bolešću, tek ćemo vidjeti.
CRISPR sustavi također se mogu koristiti za borbu protiv HIV-a i nasljednih bolesti ljudi. Međutim, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razvili učinkoviti načini liječenja. Naravno, ne govorimo o mutantima, kao u znanstvenofantastičnim filmovima, ali znanstvenici će moći brzo stvoriti genetski modificirane organizme, poput poljoprivrednih biljaka otpornih na parazite. Treba vidjeti zašto znanstvenici koji su otkrili CRISPR i shvatili kako se on može koristiti još nisu dobili Nobelovu nagradu.
Aleksandar Enikeev
