Međunarodni tim znanstvenika iz Sjedinjenih Država, Francuske i Kine stvorio je polusintetski oblik života. Iako su se već pokušavali dobiti bakterije s modificiranom DNA, mikroorganizmi su se slabo umnožili, zahtijevali su posebne uvjete uzgoja i na kraju se riješili modifikacija koje su u njih uvedene. "Lenta.ru" govori o novom radu u kojem su istraživači uspjeli riješiti ove probleme, dobivši stvorenje koje se radikalno razlikuje od cjelokupnog prirodnog života na Zemlji.
U novije vrijeme DNK svih živih organizama na našem planetu sastojala se od četiri vrste nukleotida koji su sadržavali adenin (A), ili timin (T), ili gvanin (G), ili citozin ©. Žice od desetaka ili stotina milijuna nukleotida tvore odvojene kromosome. Geni pronađeni na kromosomima u osnovi su duge nukleotidne sekvence u kojima su kodirane aminokiselinske sekvence proteina. Kombinacija tri uzastopna nukleotida (kodon ili triplet) odgovara jednoj od 20 aminokiselina. Dakle, život koristi genetički kod od tri slova (ATG, CGC i tako dalje) zasnovan na četveroslovnoj abecedi (A, C, T, G).
Kada stanici organizma treba protein (polipeptid), uključuje se gen koji ga kodira. Potonji je vezan za poseban enzim zvan RNA polimeraza, koji tijekom procesa transkripcije počinje slijediti slijed nukleotida i stvarati njegovu kopiju u obliku molekule koja se naziva glasnička RNA (mRNA). RNA je vrlo slična DNA, ali umjesto timina sadrži uracil (U). Nakon toga, mRNA napušta staničnu jezgru i usmjerava se prema ribosomima, gdje tijekom procesa translacije služi kao recept za stvaranje aminokiselinskog lanca proteina.
Istraživači su odlučili promijeniti genetski kod Escherichia coli dodajući mu dva dodatna "slova". Činjenica je da je DNA u živim organizmima dvostruka, odnosno tvore je dva lanca koja su međusobno uparena komplementarnim vezama. Takve veze nastaju između baze A-nukleotida iz jednog lanca i baze T-nukleotida iz drugog (slično, između C i G). Zbog toga se dva nova sintetička nukleotida također moraju moći komplementarno upariti. Izbor je pao na dNaM i d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Jedan par sintetičkih nukleotida umetnut je u plazmid - dvolančanu kružnu molekulu DNA koja se može množiti odvojeno od ostatka bakterijskog genoma. Zamijenili su par komplementarnih nukleotida A i T, koji su bili dio laktoznog operona - skupa gena koji metaboliziraju laktozni šećer, i nekodirajuće DNA sekvence povezane s njima. Sintetski nukleotidi nisu bili uključeni u regiju koju polimeraza kopira u mRNA.
Promotivni video:
Zašto su znanstvenici odlučili ne umetnuti sintetičke nukleotide izravno u gen, već pored njega? Činjenica je da je vrlo teško na taj način promijeniti gen kako bi on ostao funkcionalan. Napokon, za to morate rezultirajuće nove kodone vezati za bilo koju aminokiselinu. Za to je pak potrebno naučiti stanicu da proizvodi razne vrste transportne RNA (tRNA), koje mogu prepoznati ove kodone.
Molekule tRNA vrše sljedeću funkciju. Oni poput kamiona nose određenu aminokiselinu na jednom kraju, približavaju se mRNA u ribosomima i zauzvrat počinju poklapati triplet nukleotida s drugog kraja s kodonom. Ako se podudaraju, aminokiselina se uklanja i ugrađuje u protein. Međutim, ako ne postoji prikladna tRNA, protein se neće sintetizirati, što može negativno utjecati na održivost stanica. Stoga bi, umetanjem sintetičkih nukleotida u gene, znanstvenici morali stvoriti gene koji kodiraju nove tRNA koji mogu prepoznati umjetne kodone i na polipeptid prikačiti ispravnu aminokiselinu. Međutim, zadatak istraživača bio je jednostavniji. Morali su osigurati da se plazmid sa sintetičkim nukleotidima uspješno razmnoži i prenese na kćerne organizme.
Plazmidi koji se koriste za preobrazbu Escherichia coli
Slika: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Priroda / Odjel za kemiju / Istraživački institut Scripps
Ovaj plazmid, označen kao pINF, uveden je u E. coli. Međutim, da biste ga kopirali, neophodno je da je mnogo nukleotida prisutno unutar bakterijske stanice. U tu svrhu, drugi plazmid, pCDF-1b, umetnut je u E. coli. Sadržao je gen za dijatomej Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, koji kodira NTT protein, koji transportira nukleotide iz hranjivog medija u stanicu.
Međutim, znanstvenici su se suočili s nizom poteškoća. Prvo, proteini Phaeodactylum tricornutum imaju toksični učinak na stanicu E. coli. Sve zbog prisutnosti u njima fragmenta aminokiselinske sekvence, koji nosi signalnu funkciju. Zahvaljujući njoj, protein zauzima ispravan položaj u stanici alge, nakon čega se sekvenca uklanja. E. coli nije u mogućnosti ukloniti ovaj fragment, pa su joj istraživači pomogli. Uspjeli su ukloniti prvih 65 aminokiselina iz NTT-a. To je značajno smanjilo toksičnost, iako je smanjilo i brzinu prijenosa nukleotida.
Drugi je problem bio taj što su se sintetički nukleotidi dugo zadržavali u plazmidima, a nisu bili zamijenjeni prilikom kopiranja DNA. Ispostavilo se da je njihova sigurnost ovisila o tome koji su ih nukleotidi okruživali. Da bi to saznali, znanstvenici su analizirali razne kombinacije ugrađene u 16 plazmida. Da bi razumjeli je li sintetički nukleotid ispao iz niza, istraživači su koristili tehnologiju CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Slika: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 je molekularni mehanizam koji postoji unutar bakterija i omogućava im borbu protiv bakteriofaga. Drugim riječima, ova tehnologija predstavlja imunitet protiv virusnih infekcija. CRISPR je poseban dio DNK. Sadrže kratke fragmente DNA virusa koji su nekad zarazili pretke današnjih bakterija, ali su poraženi njihovom unutarnjom obranom.
Kada bakteriofag uđe u bakteriju, ti se fragmenti koriste kao predložak za sintezu molekula nazvanih crRNA. Stvoreni su mnogi različiti lanci RNA koji se vežu za protein Cas9, čiji je zadatak presjeći DNA virusa. To može učiniti tek nakon što crRNA pronađe komplementarni fragment virusne DNA.
Ako se umjesto crRNA koristi RNA sekvenca komplementarna određenom fragmentu plazmida, Cas9 će također presjeći plazmid. Ali ako u tom fragmentu postoje sintetički nukleotidi, tada protein neće raditi. Dakle, pomoću CRISPR-a moguće je izolirati one plazmide koji su otporni na neželjene mutacije. Pokazalo se da je u 13 od 16 plazmida gubitak sintetičkih nukleotida bio beznačajan.
Tako su istraživači uspjeli stvoriti organizam s temeljnim promjenama u DNK, sposoban zadržati ih u sebi neograničeno dugo.
Iako polusintetski oblik života u svom genomu ima samo dva neprirodna nukleotida, koja se ne nalaze u kodonima i nisu uključena u kodiranje aminokiselina, to je prvi rezistentni organizam čija se DNK abeceda sastoji od šest slova. U budućnosti će znanstvenici najvjerojatnije moći koristiti ovu inovaciju za sintezu proteina, stvarajući tako punopravni umjetni genetski kod.
Aleksandar Enikeev
